Kunci Identifikasi Bakteri

Pada saat kita mendapatkan tugas untuk mencari tahu jenis suatu isolat bakteri, maka hal pertama yang dilakukan adalah mengamati ciri-ciri morfologi koloni, morfologi sel dan sifat gramnya.
Pastikan isolat yang akan diuji adalah kultur murni, benar-benar murni dan telah yakin tentang kemurniannya. Jadi jika diperoleh suatu kultur murni dari suatu lingkungan dan diyakini belum murni maka haruslah diisolasi ulang, maksudnya dimurnikan lagi sampai benar-benar pasti. Lihat gambar berikut :

1 jika tidak yakin benar ini kultur murni atau tidak.

2 lakukan streak kuadran, minimal ke dua cawan (karena kalau salah satu gagal membentuk koloni tunggal, maka masih ada cadangannya).

3 lihat hasil streak kuadran, apakah tampak koloni tunggal?, koloni tunggal adalah koloni yang timbul/tumbuh dari satu sel atau beberapa kumpulan sel (untuk staphylococcus misalnya), bukan dari beberapa ratus sel. Istilah yang paling mendekati adalah CFU’s. Jadi dipastikan satu koloni itu adalah satu jenis bahkan satu strain. Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil(misalnya E.coli,1-2mm), ada juga yang besar. Faktor-faktornya mungkin adalah kecepatan pertumbuhannya dan stuktur sel itu sendiri (bayangkan sel E.coli yang sendiri-sendiri akan mudah terpisah saat digoreskan ke permukaan agar dibanding sel streptococcus.

4 jika didapatkan koloni tunggal, segera diamankan dengan menumbuhkan pada media baru (minimal 5). Kenapa harus banyak?, karena untuk menanggulangi cawan yang kontaminan, membuat stok kultur dan mencegah kejadian yang tidak diinginkan (kehilangan cawan misalnya).

5 setiap menumbuhkan ke medium baru, sebaiknya harus dicek koloninya, apakah sama dengan cawan induknya atau tidak. Jika perlu cek juga morfologi selnya.

6 sekarang kita telah memiliki beberapa kultur murni dan siap untuk diidentifikasi.

Salah satu cawan dari kultur murni tersebut lalu dikarakterisasi morfologi koloninya. Ciri-ciri koloni yang perlu diperhatikan dan dicatat yaitu bentuk koloni, tepian koloni, elevasi dll. Tapi perlu diingat jika hanya mencatat karakteristik berdasarkan ciri di atas, kita tidak terlalu hafal oleh karena itu perlu untuk digambar. Menggambar koloni itu tidak mudah. Yang perlu digambar adalah koloni tunggal, bukan koloni yang besar.jika menginginkan hasil lebih bagus sebaiknya memakai kamera dijital. Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil dengan satuan mm. Jadi beberapa saran untuk menggambar koloni yaitu:

1. cari koloni tunggal lalu gambar hati-hati dengan pensil (sebaiknya dengan skala 1:1) tanpa perbesaran. Gambar dengan mata telanjang.
2. gambar koloni lebih detail dengan mikroskop stereo atau mikroskop cahaya. Saya sarankan untuk menggunakan mikroskop cahaya. Mula-mula dengan perbesaran 4X10. jika menggunakan mikroskop cahaya penempatan cawan di meja benda harus hati-hati. Perlu digambar tampak atas dan bawah cawan. Jika menginginkan perbesaran yang lebih tinggi dapat digunakan perbesaran 10X10, tapi jangan sampai lensa mengenai media atau biakan. (bacaan lebih lanjut tentang morfologi koloni ada di sini)

Saya yakin setelah melakukan hal di atas Anda akan merasa lebih dekat, lebih memiliki, lebih intim terhadap bakteri yang diteliti. Sering saya melihat mahasiswa mengkarakterisasi koloni hanya dengan mencatat cirinya dan menggambar seadanya. Setelah koloni dikarakterisasi, dilanjutkan dengan memperhatikan bentuk sel. Ini merupakan tahap dimana menuntut mata untuk berlelah-lelah di mikroskop.Untuk melihat sel maka hal yang harus dilakukan :
o Membuat preparat ulas. Saya sarankan jangan membuat preparat ulas dari biakan cair, karena dikhawatirkan yang tumbuh bukan yang kita harapkan. Buatlah preparat ulas dari biakan padat (koloni tunggal) sehingga milyaran bakteri dalam preparat ulas tersebut adalah satu jenis. Fiksasi di atas api sebaiknya jangan dilakukan terlalu lama. Intinya fiksasi adalah menguapkan air di atas slide, bukan membakar slide dengan api. Dikhawatirkan panas akan mempengaruhi struktur sel.
o Melihat dengan mikroskop. Apakah Anda menginginkan melihat sel tersebut dalam keadaan hidup atau mati? Jika hidup keuntungannya adalah dapat mengecek motilitasnya. Namun sel bersifat transparan dan sulit terlihat bagi mata yang tidak terlatih. Jika mati (hasil fiksasi) maka sel dapat diwarnai dengan zat pewarna dan akan terkonsentrasi untuk melihat morfologinya saja. Untuk melihat sel gunakan 100X10.
Catatan : ada beberapa catatan pentingyang terkait dengan keahlian mencari lapang pandang yang relevan, bagus dan jelas.
=Kadang-kadang waktu membuat preparat ulas, kita seringkali menyebarkan suspensi tidak merata (seperti gambar). Kita harus tahu kira-kira dimana tempat/letak lapang pandang yang menampakkan sel-sel terpisah satu sama lain.untuk mendapatkan gambar yang bagus, harus dicari dimana kira-kira bagian slide yang memiliki jumlah sel yang tepat. Pada saat perbesaran 4X10, geser-geser dan cari daerah ”pinggiran”, maksudnya jika pemfiksasian tidak rata pasti terdapat penumpukan sel di suatu tempat atau pengonsentrasian sel, jadi kalau memilih di ”pinggir”, kita dapat melihat sel-sel yang jelas.

=Seingkali ditemukan pada preparat ulas basah (hidup) sel dari bakteri bacilli yang berbentuk coccus.. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan object glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacilli yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar 2D. Lihat gambar

=Gunakan kontrol. Kontrol sangat penting, meskipun sulit untuk mendapatkannya. Akan lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti.
Data yang dihasilkan sampai tahap ini berupa karakteristik morfologi koloni dan sel yang dapat dipercaya. Tahap selanjutnya berupa pewarnaan gram. Pewarnaan gram menurut saya tidak hanya menambahkan semua pewarna dan reagen secara berurutan tetapi kita harus dapat membayangkan apa yang terjadi dengan bakteri tersebut.
Sebelum melakukannya, hal yang harus diperhatikan adalah:
· Cek tanggal pembuatan zat warna dan reagen, umumnya zat warna lebih tahan lama. Namun lebih baik menggunakan yang baru. Paling tidak tidak lebih dari setengah tahun.
· Persiapkan kontrol, kontrol yang ampuh adalah E. coli dan B. Subtilis. Kontrol juga harus dalam keadaan murni. Kontrol juga dapat diperoleh dengan mengambil lapisan film langit-langit mulut atau gigi. Di dalamnya mengandung bakteri gram positif dan negatif. Namun sering kali sulit membedakan antara kotoran dan bakteri.
· Pastikan semua kultur berumur tidak lebih dari 24 jam. Kultur muda lebih baik dari kultur tua karena seringkali gram positif kehilangan kemampuan membentuk dinding selnya pada kultur tua.
CV-----------;Kalium Iodida-----------Alkohol 95%--------Safranin
Inti dari pewarnaan gram adalah membedakan sifat ”kulit” sel dalam mempertahankan kompleks CV-KI dari pelunturan (dekolorisasi) oleh etanol/alkohol 95%. Jadi dengan menganalisa dan membuat tahapan ini menjadi meyakinkan sebenarnya sudah cukup untuk mengambil kesimpulan tentang sifat gram bakteri uji. Pengontras hanya untuk memperkuat perbedaan saja.
Saran1

Hasil tiap perlakuan dilihat dengan mikroskop sehingga dapat benar-benar tahu apa yang terjadi pada sel. Warna CV sebelum ditambah KI berwarna ungu cerah, tapi setelah ditambah KI menjadi biru kehitaman.
Saran 2

.

Benar-benar diperhatikan tahapan paling krusial dalam pewarnaan gram yaitu dekolorisasi. Alkohol dapat diteteskan pada sela-sela cover glass dan object glass sehingga dapat diamati detik-detik terjadinya pelunturan. Disarankan dari berbagai sumber pelunturan dilakukan selama 5 detik dan ada yang menyebutkan 10 detik. Bakteri gram+ tidak selalu dapat mempertahankan kompleks CV-KI, namun hanya mempertahankannya lebih lama dibanding gram-. Jadi diperlukan stopwatch untuk menghitung waktu pelunturan dari bakteri uji dan kontrol. Untuk menekan kesalahan lakukan hal ini beberapa kali.
Saran 3

Buatlah preparat ulas dari ketiga bakteri (kontrol +&- dan uji) dalam satu slide. Usahakan jangan sampai tercampur dan dalam satu luasan cover glass melingkupi ulasan 3 bakteri ini. Tujuannya supaya memudahkan dalam membandingkan bakteri uji dengan kontrol dan juga memperkecil kesalahan saat pelunturan karena semua bakteri diberi perlakuan yang sama.
Saran 4. kroscek hasil pewarnaan gram konvensional dengan metode lain yaitu dengan KOH 3%. Setelah tahapan ini selesai maka didapatkan data yang diyakini benar, kemudian dapat dilanjutkan ke pengerucutan identifikasi berikutnya dengan melihat BERGEY’S, kitabnya para bacteriologist.